V oblasti výskumu a vývoja peptidu je čistota katalógových peptidov nanajvýš dôležitá. Ako špecializovaný dodávateľ katalógových peptidov chápeme význam poskytovania produktov vysokej kvality našim zákazníkom. Niekedy, napriek nášmu najlepšiemu úsiliu v počiatočných procesoch syntézy a čistenia, môže byť potrebné ďalšie čistenie katalógových peptidov. V tomto blogu preskúmame rôzne metódy a úvahy na ďalšie čistenie katalógových peptidov, ak je to potrebné.
Prečo ďalšie čistenie?
Existuje niekoľko dôvodov, prečo by bolo potrebné ďalšie čistenie katalógových peptidov. Po prvé, vo vysoko citlivých výskumných aplikáciách, ako sú testy založené na bunkách, štúdie in vivo alebo výskum štrukturálnej biológie, môže mať aj stopové množstvo nečistôt významný vplyv na experimentálne výsledky. Nečistoty by mohli potenciálne interferovať s biologickou aktivitou peptidu, čo by viedlo k falošným pozitívom alebo negatívom.
Po druhé, regulačné požiadavky v niektorých odvetviach, napríklad farmaceutiká, vyžadujú veľmi vysokú úroveň čistoty peptidov používaných pri vývoji liekov. Ak sa peptid považuje za potenciálne terapeutické činidlo, akékoľvek nečistoty by mohli predstavovať riziká pre bezpečnosť pacientov, a preto sú nevyhnutné ďalšie kroky čistenia.
Chromatografické metódy
Reverzná - fázová vysoko výkonná kvapalina kvapalina (RP - HPLC)
RP - HPLC je jednou z najčastejšie používaných metód na čistenie peptidu. Oddeľuje peptidy na základe ich hydrofóbnosti. Stacionárna fáza v Rp - HPLC je hydrofóbny materiál, zvyčajne kolón na báze oxidu kremičitého s pripútanými alkylovými reťazcami (napr. C18 alebo C8). Peptidy s rôznymi hydrofóbnosťmi budú interagovať inak so stacionárnou fázou, čo bude mať za následok rôzne retenčné časy.
Na ďalšie čistenie katalógových peptidov pomocou RP - HPLC musíme najprv vybrať vhodnú mobilnú fázu. Spoločná mobilná fáza pozostáva zo zmesi vody a organického rozpúšťadla, ako je acetonitril alebo metanol, s pridaním malého množstva kyseliny (napr. Kyselina trifluóroctová, TFA) na zlepšenie maximálneho tvaru. Úpravou gradientu organického rozpúšťadla môžeme optimalizovať separáciu cieľového peptidu od nečistôt.
Napríklad, ak máme katalógový peptid akoLL-37, antimikrobiálny peptid, čo je antimikrobiálny peptid s potenciálnymi terapeutickými aplikáciami, RP - HPLC sa môže použiť na odstránenie zostávajúcej syntézy pomocou produktov alebo degradovaných fragmentov. Purifikovaný LL - 37 sa potom môže použiť v presnejších testoch antimikrobiálnej aktivity.
Ión - výmenná chromatografia
Iónová chromatografia oddeľuje peptidy na základe ich náboja. Existujú dva hlavné typy: katión - Chromatografia Exchange (CEX) a anión - výmenná chromatografia (AEX). V CEX má stacionárna fáza negatívne nabitú skupinu a peptidy s čistým kladným nábojom sa viažu. V AEX je stacionárna fáza pozitívne nabitá a negatívne nabité peptidy sa zachovajú.
Výber medzi CEX a AEX závisí od izoelektrického bodu (PI) peptidu. Ak je PI peptidu pod pH mobilnej fázy, peptid bude mať čistý záporný náboj a AEX sa môže použiť. Naopak, ak je PI nad pH mobilnej fázy, CEX je vhodnejší.
Napríklad,Ureistachykinin II, peptid so špecifickým profilom náboja sa môže ďalej čistiť pomocou iónovej chromatografie. Starostlivým výberom mobilnej fázy pH a iónovej sily môžeme dosiahnuť dobré oddelenie cieľového peptidu od iných nabitých nečistôt.
Elektroforetické metódy
Dodecylsulfát sodný - elektroforéza polyakrylamidového gélu (SDS - stránka)
Aj keď sa SDS - stránka používa hlavne na analýzu proteínov, môže sa do určitej miery aplikovať aj na čistenie peptidu. V SDS - Page sú peptidy denaturované pomocou SDS a oddelené na základe ich molekulovej hmotnosti. Peptidy migrujú polyakrylamidovým gélom pod vplyvom elektrického poľa.
Po elektroforéze môže byť gél zafarbený na vizualizáciu peptidov. Pás zodpovedajúci cieľovému peptidu sa potom môže vyrezať z gélu a peptid môže byť eluovaný z gélovej matrice. Táto metóda má však určité obmedzenia. Elučný proces môže byť zložitý a počas čistenia môže dôjsť k určitej strate peptidu. SDS môže byť tiež ťažké úplne odstrániť z purifikovaného peptidu.
Kapilárna elektroforéza (CE)
Kapilárna elektroforéza je silnou separačnou technikou peptidov. Ponúka vysokú účinnosť separácie, krátky čas analýzy a nízku spotrebu vzoriek. CE oddeľuje peptidy na základe pomeru ich náboja - k hmotnosti. Existujú rôzne režimy CE, ako je elektroforéza kapilárnej zóny (CZE), elektroforéza kapilárneho gélu (CGE) a micelárna elektrokinetická chromatografia (MEKC).
CZE je najbežnejšie používaný režim na analýzu a čistenie peptidov. V CZE sú peptidy oddelené v kapiláre naplnenej pufrom pod elektrickým poľom. Oddelenie je založené na rozdieloch v elektroforetickej mobilite peptidov. CE môže byť spojený s rôznymi detekčnými metódami, ako je UV absorpcia, fluorescencia a hmotnostná spektrometria, aby sa zlepšila presnosť identifikácie a čistenia peptidu.
Ďalšie úvahy
Rozpustnosť
Rozpustnosť peptidu je dôležitým faktorom v procese čistenia. Ak má peptid v rozpúšťadlách čistenia zlú rozpustnosť, môže to viesť k zrážaniu počas čistenia, čo ovplyvní zotavenie a čistotu peptidu. Aby sme zlepšili rozpustnosť peptidu, môžeme upraviť pH rozpúšťadla, pridať ko - rozpúšťadlá alebo použiť špecifické solubilizačné činidlá.
Analýza čistoty
Po ďalšom čistení je rozhodujúce analyzovať čistotu peptidu. Bežné metódy analýzy čistoty zahŕňajú vysoko výkonnú kvapalinovú chromatografiu (HPLC), hmotnostnú spektrometriu (MS) a jadrovú magnetickú rezonanciu (NMR). HPLC môže poskytnúť informácie o chromatografickej čistote peptidu, zatiaľ čo MS môže potvrdiť molekulovú hmotnosť peptidu a zistiť akékoľvek nečistoty s rôznymi hmotnosťami. NMR sa môže použiť na stanovenie štruktúry a čistoty peptidu na atómovej úrovni.
Záver
Ako dodávateľ katalógových peptidov sme odhodlaní poskytovať našim zákazníkom vysokokvalitné peptidy. Ak je potrebné ďalšie čistenie katalógových peptidov, máme k dispozícii rôzne metódy, vrátane chromatografických metód, elektroforetických metód a ďalších úvah, ako je rozpustnosť a analýza čistoty. Starostlivým výberom vhodnej metódy čistenia a optimalizáciou podmienok čistenia môžeme zabezpečiť, aby peptidy spĺňajú vysoké požiadavky na čistotu našich zákazníkov.
Ak máte nejaké potreby katalógových peptidov alebo vyžadujete ďalšie služby čistenia, neváhajte nás kontaktovať kvôli obstarávaniu a diskusii. Tešíme sa na spoluprácu s vami na uspokojení vašich potrieb výskumu a vývoja peptidov.
Odkazy
- Snyder, LR, Kirkland, JJ a Dolan, JW (2010). Úvod do modernej kvapalinovej chromatografie. Wiley.
- Jorgenson, JW a Lukacs, KD (1981). Elektroforéza kapilárnej zóny. Analytical Chemistry, 53 (8), 1298 - 1302.
- Laemmli, UK (1970). Štiepenie štrukturálnych proteínov počas zostavy hlavy bakteriofátu T4. Nature, 227 (5259), 680 - 685.