Čo je to syntéza peptidov

 

Syntéza peptidov je aktívna oblasť v chémii proteínov a peptidov, ktorá typicky zahŕňa postupné pridávanie aminokyselín v definovanom poradí, aby sa chemickými metódami vytvoril peptidový reťazec. Hlavnými metódami syntézy sú syntéza v kvapalnej fáze a syntéza v tuhej fáze. V porovnaní s LPPS má SPPS tú výhodu, že je rýchlejší, jednoduchší, s menším počtom vedľajších reakcií a vyššími výťažkami.

 

Štandardná metóda SPPS, vrátane stratégií Boc (benzyl) a Fmoc (tBu).

 

 

Boc (benzyl) stratégia

V tomto syntetickom prístupe sa ako pevné nosiče používajú chlórmetylované, hydroxymetylované polystyrénové a p-metoxybenzylové (PMA) živice. -aminoskupina je chránená t-butoxykarbonylom (Boc), zatiaľ čo skupiny bočného reťazca aminokyselín sú chránené benzylovými derivátmi. Skupina Boc sa odstráni použitím čistej TFA alebo TFA v CH2CI2 a na konci syntézy sa ochranné skupiny bočného reťazca a väzby peptid-živica odstránia silnou kyselinou, ako je bezvodá kyselina fluorovodíková (HF) alebo TFMSA.

 

Stratégia Fmoc (tBu).

V tomto syntetickom prístupe sa ako pevné nosiče používajú živice Wang-živica, 2-chlórtritylchloridová živica, Rink amid-AM živica, Rink amid-MBHA živica. -aminoskupina je chránená 9-fluorenylmetoxykarbonylom (Fmoc ), zatiaľ čo skupiny postranných reťazcov aminokyselín sú chránené v kyslom prostredí labilnými ochrannými skupinami. Skupina Fmoc sa odstráni použitím 20 % piperidínu v DMF a na konci syntézy sa ochranné skupiny bočného reťazca a väzby peptid-živica odstránia pomocou 1 % -95 % TFA. Fmoc SPPS je v súčasnosti preferovanou metódou syntézy peptidov.

 

Základné princípy syntézy peptidov na tuhej fáze Fmoc

 

Vyberte si živicu

Najčastejšie používané živice v Fmoc SPPS vrátane 4-Alkoxybenzylalkoholovej (Wang) živice, 2-chlórtritylchloridovej živice, Rink Amide Resin, Rink Amide-MBHA živíc. Amidové živice sa používajú na syntézu peptidov s požadovanou C-koncovou amidáciou. Živica Wang a živica 2-Cl Trt sa bežne používajú na syntézu peptidov s požadovaným C-koncovým voľným COOH. Ale keď má C-koniec peptidu Pro a Gly ako prvú aminokyselinu, Wangova živica by sa nemala používať kvôli riziku tvorby DKP (diketopiperazínu), odporúča sa použiť 2-chlórtritylchloridovú živicu.

 

 

Pripojenie chránených aminokyselín na živice

Prvá Fmoc aminokyselina je pripojená k nerozpustnej podpornej živici cez v kyslom prostredí labilný linker.

 

Deprotekcia -amino ochrannej skupiny

Dočasná Fmoc ochranná skupina na N-konci peptidyl-živice sa odstráni pôsobením roztoku 20 % piperidínu v DMF. Táto reakcia zvyčajne skončí v priebehu 10 až 20 minút.

 

Kroky umývania

Po každej chemickej reakcii sa vykonajú premývacie kroky na odstránenie nadbytočných činidiel, vedľajších produktov a nezreagovaných molekúl zo živice. To pomáha udržiavať čistotu rastúceho peptidového reťazca.

 

Aktivácia a kopulácia chránenej aminokyseliny

Chránená aminokyselina naviazaná na živicu sa aktivuje, aby sa zvýšila jej reaktivita na spojenie s ďalšou aminokyselinou v sekvencii. Bežné aktivačné činidlá zahŕňajú HOAt, HOBt, PyBOP, PyAOP, HBTU a HATU. Spájanie zahŕňa vytvorenie peptidovej väzby medzi aktivovanou aminokyselinou a aminoskupinou rastúceho peptidového reťazca. Kaiserov test sa zvyčajne používa na monitorovanie úplnosti kopulačných reakcií.

 

Kroky umývania

Podobne ako v predchádzajúcich krokoch premývania, toto zabezpečuje odstránenie nadbytočných činidiel a vedľajších produktov po kopulačnej reakcii.

 

Odštiepenie od živice a odstránenie chrániacich skupín bočného reťazca

Akonáhle je požadovaná peptidová sekvencia syntetizovaná na živici, je odštiepená od pevného nosiča použitím štiepiaceho koktailu, ako je kyselina trifluóroctová (TFA) obsahujúca lapače, ako je tioanizol a voda. Súčasne sa odstránia ochranné skupiny bočného reťazca na aminokyselinových zvyškoch, čím sa odhalí úplne zbavený peptid pripravený na čistenie a analýzu.