Transfekcia je rozhodujúcou technikou v molekulárnej biológii, ktorá umožňuje zavedenie cudzích nukleových kyselín do buniek, čo vedcom umožňuje študovať génovú funkciu, expresiu proteínov a bunkových signálnych dráh. Bunky TET-213, bunková línia ľudskej neuroblastómu, sa bežne používajú vo výskume neurovedy kvôli ich neuronálnym vlastnostiam. V tomto blogovom príspevku sa podelím o niekoľko poznatkov o tom, ako efektívne transfekovať bunky TET-213, čím čerpá z mojej skúsenosti ako dodávateľa buniek TET-213.
Pochopenie buniek TET-213
Predtým, ako sa ponoríte do procesu transfekcie, je dôležité porozumieť charakteristikám buniek TET-213. Tieto bunky sú odvodené od ľudského neuroblastómu a vykazujú neuronálne znaky, ako je schopnosť rozširovať neurity a exprimovať neuronálne markery. Sú to adherentné bunky, ktoré dobre rastú v štandardných podmienkach bunkovej kultúry, zvyčajne v médiu doplnenom fetálnym hovädzím sérom (FBS) a antibiotikami.
Výber správnej metódy transfekcie
Existuje niekoľko metód na transfekciu buniek, z ktorých každá má vlastné výhody a obmedzenia. Výber transfekčnej metódy závisí od rôznych faktorov vrátane typu nukleovej kyseliny, ktorá sa má transfekovať, typu buniek a požadovanej účinnosti transfekcie. Tu je niekoľko bežných metód transfekcie vhodné pre bunky TET-213:
Transfekcia na báze lipidov
Transfekcia na báze lipidov je jednou z najpoužívanejších metód na zavedenie nukleových kyselín do buniek. Zahŕňa použitie lipidových reagentov, ktoré tvoria komplexy s nukleovou kyselinou, ktoré sa potom bunky prijímajú endocytózou. Transfekcia na báze lipidov je relatívne ľahko vykonateľná a môže dosiahnuť vysokú transfekciu v mnohých typoch buniek vrátane buniek TET-213.
Elektroporácia
Elektroporácia je fyzikálna metóda, ktorá využíva elektrické pole na vytváranie dočasných pórov v bunkovej membráne, čo umožňuje nukleovú kyselinu vstúpiť do buniek. Táto metóda je obzvlášť užitočná na transfekciu buniek, ktoré je ťažké transfekovať pomocou iných metód, ako sú napríklad primárne bunky. Elektroporácia však môže byť pre bunky škodlivejšia a môže si vyžadovať optimalizáciu parametrov elektroporácie na dosiahnutie vysokej účinnosti transfekcie.
Vírusová transdukcia
Vírusová transdukcia zahŕňa použitie vírusových vektorov na dodanie nukleovej kyseliny do buniek. Vírusové vektory sú odvodené z vírusov, ktoré boli skonštruované na prepravu požadovanej nukleovej kyseliny a môžu účinne infikovať bunky. Vírusová transdukcia môže dosiahnuť vysokú transfekciu a môže sa použiť na transfekciu širokého rozsahu typov buniek vrátane buniek TET-213. Vírusová transdukcia si však vyžaduje špecializované vybavenie a odborné znalosti a existujú potenciálne bezpečnostné obavy spojené s používaním vírusových vektorov.
Príprava buniek na transfekciu
Správna príprava buniek je nevyhnutná pre úspešnú transfekciu. Tu je niekoľko krokov, ktoré treba nasledovať pri príprave buniek TET-213 na transfekciu:
Bunková kultúra
Udržujte bunky TET-213 vo vhodnom médiu bunkovej kultúry doplneného FBS a antibiotikami. Pravidelne priechod buniek, aby sa udržala ich exponenciálna fáza rastu. Je dôležité používať zdravé, aktívne rastúce bunky na transfekciu, pretože bunky v slabom fyziologickom stave môžu mať nižšiu účinnosť transfekcie.
Očkovanie buniek
Nastavte bunky TET-213 do kultivačnej misky alebo viacerých platničiek pri primeranej hustote. Hustota očkovania závisí od metódy transfekcie a od typu experimentu. Pri transfekcii na báze lipidov sa zvyčajne odporúča hustota nasadenia 50-80%.
Inkubácia buniek
Inkubujte naočkované bunky vo zvlhčovanom inkubátore pri 37 ° C s 5% CO2 najmenej 24 hodín pred transfekciou, aby sa bunky umožnili pripevniť a zotaviť sa z procesu očkovania.
Vykonanie transfekcie
Akonáhle sú bunky pripravené, je čas vykonať transfekciu. Tu je všeobecný protokol na transfekciu lipidových buniek TET-213:
Pripravte transfekčné činidlo
Postupujte podľa pokynov výrobcu na prípravu transfekčného činidla na báze lipidov. Zvyčajne to zahŕňa riedenie činidla vo vhodnom transfekčnom médiu.
Pripravte nukleovú kyselinu
Pripravte sa na transfekciu nukleovej kyseliny, ako je plazmidová DNA alebo siRNA. Zriedte nukleovú kyselinu vo vhodnom transfekčnom médiu.
Tvoriť transfekčný komplex
Zriedte zriedené transfekčné činidlo a zriedenú nukleovú kyselinu v skúmavke a inkubujte pri teplote miestnosti počas 15-30 minút, aby ste umožnili tvorbu transfekčného komplexu.
Pridajte do buniek transfekčný komplex
Odstráňte kultivačné médium z buniek a nahradte ho čerstvým transfekčným médiom. Pridajte transfekčný komplex k bunkám, ktoré sa majú a jemne krúžte doštičku, aby sa komplex rovnomerne distribuoval.
Inkubovať bunky
Inkubujte transfekované bunky vo zvlhčovanom inkubátore pri 37 ° C s 5% CO2 na primerané množstvo času, v závislosti od typu nukleovej kyseliny a experimentu. Na transfekciu plazmidovej DNA je typ inkubácie 24-48 hodín typicky dostatočný na to, aby umožnil génovú expresiu.
Hodnotenie účinnosti transfekcie
Po transfekcii je dôležité posúdiť účinnosť transfekcie, aby sa určilo, či bola transfekcia úspešná. Existuje niekoľko metód na hodnotenie účinnosti transfekcie vrátane:
Fluorescenčná mikroskopia
Ak transfekovaná nukleová kyselina kóduje fluorescenčný proteín, ako je GFP, na vizualizáciu transfekovaných buniek sa môže použiť fluorescenčná mikroskopia. Percento fluorescenčných buniek sa môže použiť ako odhad účinnosti transfekcie.
Prietoková cytometria
Prietoková cytometria sa môže použiť na kvantifikáciu percenta transfekovaných buniek na základe expresie fluorescenčného markera alebo antigénu bunkového povrchu. Táto metóda poskytuje presnejšie a kvantitatívnejšie meranie účinnosti transfekcie v porovnaní s fluorescenčnou mikroskopiou.
Western blotting alebo qPCR
Ak transfekovaná nukleová kyselina kóduje záujmový proteín, na detekciu expresie proteínu na úrovni proteínu alebo mRNA sa môže použiť Western blotting alebo qPCR. Táto metóda môže poskytnúť informácie o úrovni génovej expresie a funkčnosti transfekovaného proteínu.
Riešenie problémov so spoločnými problémami s transfekciou
Transfekcia môže byť niekedy náročná a existuje niekoľko bežných problémov, ktoré sa môžu vyskytnúť. Tu je niekoľko tipov na riešenie problémov pre bežné problémy s transfekciou:
Nízka účinnosť transfekcie
- Skontrolujte kvalitu a množstvo nukleovej kyseliny. Uistite sa, že nukleová kyselina je čistá a vysoká kvalita.
- Optimalizujte podmienky transfekcie, ako je koncentrácia transfekčného činidla, pomer nukleovej kyseliny k reakcii a čas inkubácie.
- Skontrolujte zdravie a životaschopnosť buniek. Pred transfekciou sa uistite, že bunky sú zdravé a aktívne rastú.
- Vyskúšajte inú metódu transfekcie alebo činidlo.
Toxicita
- Znížte koncentráciu transfekčného činidla alebo nukleovej kyseliny.
- Optimalizujte podmienky transfekcie, aby sa minimalizovalo poškodenie buniek.
- Používajte inú metódu transfekcie alebo činidlo, ktoré je pre bunky menej toxické.
Účinnosť premennej transfekcie
- Uistite sa, že bunky sú rovnomerne naočkované a pri primeranej hustote.
- Pred pridaním do buniek dôkladne zmiešajte transfekčný komplex.
- Inkubujte bunky za konzistentných podmienok, aby sa minimalizovala variabilita.
Záver
Transfekčné bunky TET-213 môžu byť náročným, ale prospešným procesom. Výberom správnej metódy transfekcie, správneho prípravy buniek a podľa príslušného protokolu môžete dosiahnuť vysokú účinnosť transfekcie a získať spoľahlivé výsledky. Ak máte akékoľvek otázky alebo potrebujete ďalšiu pomoc s bunkovou transfekciou TET-213, neváhajte nás kontaktovať. Sme popredným dodávateľom buniek TET-213 a môžeme vám poskytnúť vysokokvalitné bunky, transfekčné činidlá a technickú podporu.
Okrem buniek TET-213 ponúkame aj širokú škálu peptidov vrátaneGalanan (človek),Cyklo (RGDFC)aDynorfín A (1-13), amid, ošípaný. Tieto peptidy sa môžu použiť v rôznych výskumných aplikáciách, ako je neuroveda, výskum rakoviny a objavovanie liekov.
Ak máte záujem o nákup buniek TET-213 alebo niektorého z našich peptidov, kontaktujte nás a prediskutujte svoje konkrétne potreby. Tešíme sa na spoluprácu s vami a pomôžeme vám dosiahnuť vaše výskumné ciele.
Odkazy
- Sambrook, J. a Russell, DW (2001). Molekulárne klonovanie: laboratórna príručka. Cold Spring Harbour Laboratory Press.
- Ausubel, FM, Brent, R., Kingston, RE, Moore, DD, Seidman, JG, Smith, JA, & Struhl, K. (Eds.). (2002). Súčasné protokoly v molekulárnej biológii. John Wiley & Sons.
- Chen, C., & Okayama, H. (1987). Vysokoúčinná transformácia cicavčích buniek plazmidovou DNA. Molekulárna a bunková biológia, 7 (8), 2745-2752.
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., & Hofschneider, PH (1982). Prenos génov do myších lyómových buniek elektroporáciou vo vysokých elektrických poliach. Embo Journal, 1 (7), 841-845.
- Naldini, L., Blomer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan, R., Gage, FH, ... & Verma, IM (1996). In vivo dodávanie génov a stabilná transdukcia nedivívajúcich buniek lentivírusovým vektorom. Science, 272 (5259), 263-267.