Systemin je dobre známy rastlinný peptidový hormón, ktorý hrá kľúčovú úlohu v obrannej odpovedi rastliny proti bylinožravcom a patogénom. Ako popredný dodávateľ Systeminu je pochopenie spôsobu detekcie Systeminu v rastlinách mimoriadne dôležité nielen pre vedecký výskum, ale aj pre zabezpečenie kvality a pravosti produktov Systemin, ktoré ponúkame. V tomto blogu preskúmame rôzne metódy detekcie Systeminu v rastlinách a ponoríme sa do vedeckých princípov každého prístupu.
1. Imunologické metódy detekcie
Imunologické detekčné techniky sú široko používané na detekciu Systeminu v rastlinách kvôli ich vysokej špecifickosti a citlivosti. Tieto metódy sú založené na použití protilátok, ktoré špecificky rozpoznávajú a viažu sa na Systemin.
Enzým - Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
ELISA je bežne používaná imunologická metóda. Zahŕňa potiahnutie mikrodoštičky protilátkou špecifickou pre Systemin. Rastlinné extrakty sa potom pridajú do jamiek mikroplatničky. Ak je Systemin prítomný v extrakte, naviaže sa na imobilizovanú protilátku. Následne sa pridá druhá protilátka konjugovaná s enzýmom. Táto sekundárna protilátka sa tiež viaže na Systemin. Po vymytí všetkých nenaviazaných látok sa pridá substrát pre enzým. Enzým-substrátová reakcia vytvára detegovateľný signál, často zmenu farby, ktorú je možné merať fotometricky. Intenzita signálu je úmerná množstvu Systemínu vo vzorke.
Medzi výhody ELISA patrí vysoká citlivosť, schopnosť spracovať viacero vzoriek súčasne a relatívne jednoduché použitie. Vyžaduje si to však produkciu kvalitných protilátok a krížová reaktivita s inými peptidmi v rastlinnom extrakte môže byť niekedy problémom.
Western blotting
Western blotting je ďalšou silnou imunologickou technikou. Najprv sa rastlinné proteíny extrahujú a separujú gélovou elektroforézou na základe ich molekulovej hmotnosti. Oddelené proteíny sa potom prenesú na membránu. Protilátka špecifická pre Systemin sa inkubuje s membránou. Po premytí sa pridá sekundárna protilátka konjugovaná s detekčným činidlom (ako je fluorescenčný alebo chemiluminiscenčný marker). Prítomnosť Systeminu je vizualizovaná ako zreteľný pás na membráne.
Western blotting umožňuje určiť molekulovú hmotnosť Systeminu a môže poskytnúť informácie o jeho možných modifikáciách. V porovnaní s ELISA je však časovo aj technicky náročnejšia.
2. Hmotnostná spektrometria - založená detekcia
Hmotnostná spektrometria (MS) je vysoko presná a všestranná metóda na detekciu Systeminu v rastlinách. Dokáže identifikovať a kvantifikovať peptidy na základe ich pomeru hmotnosti a náboja (m/z).
Kvapalinová chromatografia - hmotnostná spektrometria (LC - MS)
Pri LC - MS sa rastlinné extrakty najskôr oddelia kvapalinovou chromatografiou. Oddelené zložky sa potom zavedú do hmotnostného spektrometra. Hmotnostný spektrometer ionizuje molekuly a meria ich hodnoty m/z. Porovnaním získaných hodnôt m/z s teoretickými m/z Systeminu je možné potvrdiť prítomnosť Systeminu.
LC - MS ponúka vysoké rozlíšenie a schopnosť detekovať Systemin aj v zložitých rastlinných matriciach. Môže tiež poskytnúť informácie o štruktúre a možných posttranslačných modifikáciách Systeminu. Vyžaduje si to však drahé vybavenie a vysoko kvalifikovaný personál.
Tandemová hmotnostná spektrometria (MS/MS)
MS/MS je rozšírením hmotnostnej spektrometrie. Po počiatočnej hmotnostnej analýze v prvom hmotnostnom spektrometri sa vybrané ióny fragmentujú a fragmenty sa analyzujú v druhom hmotnostnom spektrometri. To umožňuje určenie aminokyselinovej sekvencie Systeminu, čo je nevyhnutné na potvrdenie jeho identity.
MS/MS je obzvlášť užitočná pri práci so vzorkami, kde môžu byť izobarické alebo izomérne peptidy, ktoré by mohli interferovať s identifikáciou. Poskytuje podrobné štrukturálne informácie o Systemine, ale je tiež zložitejšia a časovo náročnejšia ako jednostupňová hmotnostná spektrometria.
3. Molekulárna biológia – detekcia založená na molekulárnej biológii
Techniky molekulárnej biológie možno použiť aj na detekciu Systeminu na úrovni génovej expresie.
Reverzná transkripcia - Polymerázová reťazová reakcia (RT - PCR)
RT - PCR sa používa na detekciu mRNA kódujúcej Systemin. Najprv sa z rastlinných tkanív extrahuje celková RNA. mRNA je potom reverzne transkribovaná do komplementárnej DNA (cDNA) pomocou reverznej transkriptázy. Na amplifikáciu cDNA pomocou PCR sa používajú špecifické priméry pre gén Systemin. Amplifikované fragmenty DNA môžu byť vizualizované gélovou elektroforézou.
RT - PCR umožňuje detekciu expresie génu Systemin, ktorá môže indikovať fyziologický stav rastliny z hľadiska jej obrannej reakcie. Poskytuje však iba informácie o potenciálnej produkcii Systeminu na transkripčnej úrovni a nemeria priamo prítomnosť samotného peptidu.
Kvantitatívna PCR v reálnom čase (qRT - PCR)
qRT - PCR je pokročilejšia verzia RT - PCR. Umožňuje kvantifikáciu množstva Systemin mRNA vo vzorke. Počas PCR reakcie sa na monitorovanie amplifikácie v reálnom čase používa fluorescenčné farbivo alebo fluorescenčne značená sonda. Cyklus, v ktorom fluorescenčný signál prekročí prah (hodnota Ct), je nepriamo úmerný množstvu cieľovej mRNA.
qRT - PCR poskytuje presnejšiu kvantifikáciu expresie génu Systemin v porovnaní s tradičnou RT - PCR. Je užitočný na štúdium regulácie produkcie Systeminu v reakcii na rôzne stimuly.
4. Bioanalýza - detekcia založená na bioanalýze
Biologické testy sa spoliehajú na biologickú aktivitu Systeminu na zistenie jeho prítomnosti. Napríklad je známe, že Systemin indukuje syntézu inhibítorov proteázy v rastlinách. Biologický test možno pripraviť ošetrením rastlinných tkanív vzorkou, pri ktorej existuje podozrenie, že obsahuje Systemín, a potom meraním indukcie inhibítorov proteázy.
Výhodou biotestov je, že priamo merajú biologickú aktivitu Systeminu. Sú však menej špecifické v porovnaní s inými metódami a môžu byť ovplyvnené inými faktormi v rastlinnom extrakte, ktoré môžu tiež ovplyvniť syntézu inhibítora proteázy.
Záver
Ako dodávateľ Systemin chápeme dôležitosť presnej a spoľahlivej detekcie Systemin. Každá z vyššie opísaných metód má svoje výhody a obmedzenia. Imunologické metódy sú vysoko špecifické a citlivé, hmotnostná spektrometria poskytuje podrobné informácie o štruktúre, techniky molekulárnej biológie ponúkajú pohľad na génovú expresiu a biologické testy merajú biologickú aktivitu. V praxi sa môže použiť kombinácia týchto metód na zabezpečenie presnej detekcie a kvantifikácie Systeminu v rastlinách.
Ak máte záujem o kúpu vysoko kvalitného Systeminu pre váš výskum alebo iné aplikácie, pozývame vás, aby ste nás kontaktovali pre ďalšie diskusie. Zaviazali sme sa poskytovať vám tie najlepšie produkty a služby. Tiež by vás mohli zaujať niektoré z našich ďalších peptidových produktov, ako naprFragment glykoproteínu IIb (296 - 306),PHM - 27 (človek), aSecretin (potkan).
Referencie
- Ryan, CA (2000). Systémová signálna dráha: diferenciálna aktivácia obranných génov rastlín. Biochimie, 82(10-11), 847-853.
- Schilmiller, AL, & Howe, GA (2005). Systemín: polypeptidový signál pre obranné reakcie rastlín. Aktuálna biológia, 15(18), R744 - R747.
- van der Hoorn, RA a Jones, JD (2004). Proteázy v obrane patogénov. Current Opinion in Plant Biology, 7(4), 400 - 406.