Hej! Som dodávateľom buniek TET - 213 a dnes vás prevediem, ako vykonať na týchto bunkách farbenie imunofluorescencie. Imunofluorescenčné farbenie je veľmi užitočnou technikou vo svete bunkovej biológie. Pomáha nám vizualizovať špecifické proteíny v bunkách, čo nám dáva lepšie pochopenie ich funkcií a miest.
Príprava buniek TET - 213
Najprv je potrebné pripraviť naše bunky TET - 213. Začnite tým, že ich pestujete v vhodnom kultúrnom médiu. Tieto bunky sa zvyčajne darí dobre v médiu, ako je RPMI 1640 doplnené 10% fetálnym hovädzím sérom (FBS) a 1% penicilínom - streptomycínom. Inkubujte bunky pri 37 ° C v 5% CO₂ atmosfére.
Akonáhle bunky dosiahnu asi 70 - 80% sútoku, je čas začať proces farbenia. Budete musieť nasadiť bunky na krycie sklipty do dosky 24 - jamky. To uľahčuje manipuláciu s bunkami počas sfarbenia. Použite pipetu na starostlivo prenos suspenzie buniek na krycie sklíčka. Nezabudnite rovnomerne distribuovať bunky.
Fixácia buniek
Po pripojení buniek k krycie sklipty (zvyčajne po 24 hodinách), je čas ich opraviť. Fixácia je rozhodujúca, pretože zachováva bunkovú štruktúru a udržuje proteíny na svojom mieste. Môžete použiť fixatívu, ako je 4% paraformaldehyd (PFA) vo fosfátovom tlmenom soľnom roztoku (PBS). Pridajte dostatok PFA na zakrytie buniek na krycích sklíčkach a nechajte ho sedieť pri teplote miestnosti asi 15 - 20 minút.
Po dokončení fixácie umyte bunky trikrát PBS. Každé umývanie by malo trvať asi 5 minút. To pomáha odstraňovať nadbytočnú fixáciu z buniek.
Permeabilizácia
Ďalej je permeabilizácia. Tento krok umožňuje protilátkam vstúpiť do buniek a viazať sa na cieľové proteíny. V PBS použite permeabilizačné činidlo, ako je 0,1% Triton X - 100. Pridajte permeabilizačný roztok do buniek a nechajte ho inkubovať pri teplote miestnosti asi 10 minút.
Potom znova umyte bunky trikrát pomocou PBS, rovnako ako v predchádzajúcom kroku. To zaisťuje, že permeabilizačné činidlo je úplne odstránené.
Blokovanie
Blokovanie je dôležitým krokom na zabránenie ne -špecifickej väzby protilátok. V PBS môžete použiť blokovacie roztok, ako je napríklad 5% hovädzí sérumový albumín (BSA). Pridajte blokovací roztok do buniek a nechajte ho inkubovať pri teplote miestnosti asi 1 hodinu.
Inkubácia primárnej protilátky
Teraz je čas pridať primárnu protilátku. Primárna protilátka je špecifická pre proteín, ktorý chcete zistiť v bunkách TET - 213. Zriedite primárnu protilátku v blokovacom roztoku podľa pokynov výrobcu.
Opatrne odstráňte blokovací roztok z buniek a pridajte zriedenú primárnu protilátku. Uistite sa, že bunky úplne zakryli roztokom protilátky. Inkubujte bunky s primárnou protilátkou cez noc pri 4 ° C. Tento dlhý inkubačný čas umožňuje, aby sa protilátka účinne viazala na cieľový proteín.
Nasledujúci deň umyte bunky trikrát PBS, pričom každé premytie trvá asi 5 minút. Zbavuje sa to akejkoľvek neviazanej primárnej protilátky.
Inkubácia sekundárnej protilátky
Po inkubácii primárnej protilátky je čas na sekundárnu protilátku. Sekundárna protilátka je označená fluorescenčným farbivom, čo nám umožňuje vizualizovať cieľový proteín pod fluorescenčným mikroskopom.
Zriedte sekundárnu protilátku v blokovacom roztoku podľa pokynov výrobcu. Odstráňte PBS z buniek a pridajte zriedenú sekundárnu protilátku. Inkubujte bunky pri teplote miestnosti asi 1 - 2 hodiny v tme. Tmavé prostredie je dôležité, aby sa zabránilo vyblednutiu fluorescenčného farbiva.
Po skončení inkubácie umyte bunky trikrát pomocou PBS, rovnako ako predtým.
Protiklad
Kontrastné farbenie sa používa na vizualizáciu bunkových jadier. Môžete použiť farbivo ako DAPI (4 ', 6 - Diamidino - 2 - fenylindol). Zriedite DAPI v PBS a pridajte ho do buniek. Nechajte ho inkubovať pri teplote miestnosti asi 5 minút.
Potom znova umyte bunky PBS, aby ste odstránili nadbytok DAPI.
Montáž
Nakoniec je čas namontovať krycie sklíčka na sklíčka mikroskopu. Používajte montážne médium, ktoré pomáha udržiavať bunky na svojom mieste a tiež zachováva fluorescenciu. Opatrne položte kvapku montážneho média na sklíčko mikroskopu a potom prevráťte krycí sklíčku na kvapku. Uistite sa, že medzi krycom a posúvačom nie sú žiadne vzduchové bubliny.
Zobrazovanie
Teraz ste pripravení predstaviť bunky pod fluorescenčným mikroskopom. Na vizualizáciu fluorescenčných signálov zo sekundárnej protilátky a DAPI použite vhodné filtre. Môžete urobiť viac obrázkov v rôznych zorných poliach, aby ste získali dobré znázornenie buniek.
Použitie súvisiacich peptidov v procese
Počas bunkovej kultúry a procesu farbenia môžete tiež nájsť niektoré peptidy za užitočné. Napríklad(Gly14) -humanín (človek)Ukázalo sa, že má určité priaznivé účinky na životaschopnosť a funkciu buniek. Môžete ho pridať do kultivačného média, aby ste zistili, či ovplyvňuje expresiu proteínu, ktorú študujete v bunkách TET - 213.
Peptid fibronektínu CS1pred nasadením buniek sa môže použiť na pokrytie krycích sklíčka. To môže zvýšiť pripevnenie a šírenie buniek, čím sa proces farbenia efektívnejší.
Endotelín - 1 (11 - 21)Môže tiež hrať úlohu v signálnych dráhach v bunkách TET - 213. Môžete ho pridať do kultivačného média a potom študovať, ako ovplyvňuje expresiu cieľového proteínu prostredníctvom imunofluorescenčného farbenia.
Záver
Vykonanie imunofluorescenčného zafarbenia na bunkách TET - 213 môže byť trochu zložitým procesom, ale ak budete postupovať opatrne, mali by ste byť schopní získať nejaké skvelé výsledky. Je to výkonná technika, ktorá vám môže poskytnúť cenné informácie o biológii týchto buniek.
Ak máte záujem o kúpu buniek TET - 213 alebo niektorého z súvisiacich peptidov uvedených v tomto blogu, neváhajte a oslovte nás, kde nájdete ďalšie informácie a začnite diskusiu o obstarávaní. Sme tu, aby sme vám pomohli so všetkými vašimi potrebami bunkovej biológie.
Odkazy
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., & Walter, P. (2002). Molekulárna biológia bunky. Garland Science.
- Pollard, TD a Earnshaw, WC (2004). Bunková biológia. Saunders.